Ago蛋白新应用：上海交大冯雁团队开发Ago-PCR，实现低丰度突变基因的超高灵敏度检测

对血液或体液中肿瘤细胞释放的DNA片段进行液体活检，以其无创、灵敏、动态的特点，可以实现肿瘤的早期筛查和伴随诊断。然而，由于游离核酸含量低且易降解，在复杂背景基因中特异性富集和检测肿瘤基因已受到广泛关注。常用的PCR等方法具有简单省时的优点，但检测灵敏度有限；近年来，基因编辑工具CRISPR/Cas在核酸检测中的应用提高了检测的灵敏度和方便性。然而，由于Cas酶对靶序列PAM的选择性和长RNA导向物昂贵且不稳定的合成，检测的成本、灵敏度和多样性仍然有限。因此，开发能够特异性富集靶序列的新型核酸酶是解决上述问题的有效途径，建立一种灵敏度高、多样性强、简便易行的新型核酸检测技术对基础研究和临床应用具有重要意义。近日，上海交通大学生命科学与技术学院微生物代谢国家重点实验室 严丰 该团队在《核酸研究》杂志上发表了题为: 阿戈纳特集成单管聚合酶链反应系统能够超灵敏检测罕见突变 文章。本研究揭示了不同嗜热微生物的精氨酸蛋白 (Ago蛋白) 的核酸酶特性， 发现突变为单碱基 (SNV) 目标序列的精确识别规律 ，开发了用于多种核酸富集和检测的“一管”聚合酶链反应 阿星 （ A 定向前进 S 特定的 焦油 获取富集和检测) 新策略， 实现血液等样品中低丰度突变基因的高效、多重富集和检测。在对嗜热微生物Ago蛋白的系统研究中，研究小组揭示了其优异的特性如高温稳定性、可编程性、比催化活性和多重正交反应，并提出 阿尔古英雄 (前) 核酸酶-聚合酶链反应耦合 “of” 阿星 " （ A 定向前进 S 特定的 焦油 获取富集和检测) 核酸检测和富集的新策略 (图1) 。巧妙采用导向基因的“两点错配”设计策略，使Ago蛋白在聚合酶链反应中变性 (94℃) 选择性切割野生型基因，剩余的突变基因可以在聚合酶链反应中退火 (~58℃) 和延伸(~ 72℃)，从而实现低丰度突变基因的超高效富集和准确检测。研究人员对KRAS、PIK3CA、EGFR等几个肿瘤突变基因进行了富集，证实A-Star可以检测到0.01%的低丰度突变，富集效率高达5500倍。图1。“A-STAR”低丰度 SNV富集检测原理“A-Star”可稳定检测血液、实体肿瘤组织等复杂样品中的肿瘤靶基因 (图2A) 。考虑到实际样品中可能存在多种基因突变，“A-Star”通过设计多对DNA导向链，可以在单酶“一管”反应体系中检测多个肿瘤基因，信号之间不存在交叉干扰 (图2B) 。图2。“a-star”用于临床样本(A)和多种肿瘤突变(b)  的富集检测，简而言之，本研究建立的“A-Star”低丰度核酸富集检测技术具有极高的灵敏度、简便、快速和多重检测等优点，在基因诊断、遗传病治疗等分子生物学和医学领域具有重要的应用潜力。上海交通大学副研究员刘谦和博士生郭翔是本文的合著者，严丰教授是通讯作者。研究工作由上海交通大学、上海交通大学第一附属医院、仁济医院、仁和未来生物技术公司等完成。上海交通大学转化医学中心提供研究平台支持。论文链接: https://doi.org/10.1093/nar/gkab274